Окраска спор по ожешко

Окраска по Ожешко

Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет.

Методика окраски по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий.

Окраска по Романовского-Гимза.

Методика окраски по Романовскому-Гимза:

Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии — в фиолетовый цвет, лептоспиры — в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

К работе № 3 Теоретическая справка

Исследование микроорганизмов в живом состоянии для изучения форм и подвижности.

Техника приготовления препаратов «висячая» и «раздавленная» капли

1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.

studopedia.org

Окраска спор по ожешко

Глава 3. Основы классификации и морфология микроорганизмов — О. Б. Орлеанская

Микроорганизмы (от лат. micros — малый) — организмы, невидимые невооруженным глазом. К ним относятся простейшие, спирохеты, грибы, бактерии, вирусы, изучением которых занимается микробиология. Величина микроорганизмов измеряется в микрометрах (мкм). В микромире существует большое разнообразие форм, которые делятся на группы с учетом общих принципов биологической классификации.

Первой общей биологической классификацией была созданная в XVIII веке система шведского ученого К. Линнея, основанная на морфологических признаках и включавшая животный и растительный мир. С развитием науки в классификации стали учитывать не только морфологические, но и физиологические, биохимические и генетические особенности микроорганизмов. В настоящее время невозможно говорить об единой классификации всех живых организмов: сохраняя единые принципы, классификации макро- и микроорганизмов имеют свои особенности.

Основными ступенями всех классификаций являются: царство — отдел — класс (группа) — порядок — семейство — род — вид. Главной классификационной категорией является вид — совокупность организмов, имеющих общее происхождение, сходные морфологические и физиологические признаки и обмен веществ.

Микроорганизмы относятся к царству прокариотов, представители которых, в отличие от эукариотов, не обладают оформленным ядром. Наследственная информация у прокариотов заключена в молекуле ДНК, располагающейся в цитоплазме клетки.

Для микроорганизмов принята в 1980 г. единая международная классификация, в основе которой лежит система, предложенная американским ученым Берги.

Для того чтобы определить, к какому виду относится микроорганизм, необходимо с помощью различных методов изучить его особенности (форму клетки, спорообразование, подвижность, ферментативные свойства) и по определителю найти его систематическое положение — идентифицировать.

Внутри вида существуют варианты: морфоварианты отличаются по морфологии, биоварианты — по биологическим свойствам, хемоварианты — по ферментативной активности, сероварианты — по антигенной структуре, фаговарианты — по чувствительности к фагам.

Для обозначения микроорганизмов принята общебиологическая бинарная или биноминальная (двойная) номенклатура, введенная К.Линнеем. Первое название обозначает род и пишется с прописной буквы. Второе название обозначает вид и пишется со строчной буквы. Например, Staphylococcus aureus — стафилококк золотистый. В названиях могут быть отражены имена исследователей, открывших микроорганизмы: бруцеллы — в честь Брюса, эшерихии — в честь Эшериха и т. д. В ряд наименований включены органы, которые поражает данный микроорганизм: пневмококки — легкие, менингококки — мозговую оболочку и т. д.

Бактерии — это одноклеточные организмы, лишенные хлорофилла. Средние размеры бактериальной клетки — 2-6 мкм. Размеры и форма клеток бактерий, присущие микроорганизмам определенного вида, могут изменяться под влиянием различных факторов (в зависимости от возраста бактериальной культуры, среды обитания и пр). Это явление называется полиморфизмом.

По форме клетки бактерии делятся на три группы: шаровидные, палочковидные и извитые (рис. 4).


Рис. 4. Формы микроорганизмов и методы их окраски. а — шаровидные бактерии: 1 — стафилококки (окраска по Граму); 2 — стрептококки (окраска по Граму); 3 — пневмококки (окраска по Бурри — Гинсу); 4 — менингококки и гонококки (окраска по Граму); б — палочковидные бактерии: 1 — кишечные палочки (окраска по Граму); 2 — возбудитель дифтерии (окраска метиленовым синим); 3 — возбудитель туберкулеза (окраска по Цилю — Нильсену); 4 — возбудитель столбняка (окраска по Ожешко); 5 — холерный вибрион (окраска по Граму); в — спирохета: 1 — бледная трепонема; 2 — спирохета возвратного тифа; 3 — лептоспиры

Шаровидные бактерии называются кокки (от лат. coccus — ягода) и имеют диаметр клетки от 0,5 до 1 мкм. Форма кокков разнообразна: сферическая, ланцетовидная, бобовидная. По взаимному расположению клеток после деления среди кокков выделяют: микрококки (от лат. micros — малый) — клетки делятся в разных плоскостях и располагаются поодиночке; диплококки (от лат. diploos — двойной) — клетки делятся в одной плоскости и затем располагаются попарно; к ним относятся ланцетовидные пневмококки и бобовидные гонококки и менингококки; стрептококки (от лат. streptos — цепочка) — клетки делятся в одной плоскости и не расходятся, образуя цепочку; стафилококки (от лат. staphyle — гроздь) — клетки делятся в различных плоскостях, образуя скопления в виде грозди винограда; тетракокки (от лат. tetra — четыре) — клетки делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и располагаются по четыре; сарцины (от лат. sarcio — соединяю) — клетки делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и располагаются в виде тюков или пакетов по 8 или 16 клеток в каждом.

Кокки широко распространены во внешней среде, а также в организме человека и животных. Почти все группы кокков, исключая микрококки, тетракокки и сарцины, включают возбудителей инфекционных заболеваний.

Палочковидные формы называются бактериями. Средние размеры их от 1 до 6 мкм в длину и от 0,5 до 2 мкм в толщину.

Бактерии различаются по внешнему виду: концы их могут быть закругленными (кишечная палочка), обрубленными (возбудитель сибирской язвы), заостренными (возбудитель чумы) или утолщенными (возбудитель дифтерии). После деления бактерии могут располагаться попарно — диплобактерии (клебсиеллы), цепочкой (возбудитель сибирской язвы), иногда под углом друг к другу или крест-накрест (возбудитель дифтерии). Большинство бактерий располагается беспорядочно.

Среди бактерий встречаются изогнутые формы — вибрионы (возбудитель холеры).

К извитым формам относятся спириллы и спирохеты. Форма их клетки напоминает спираль. Большинство спирилл неболезнетворны.

Строение бактериальной клетки

Для изучения строения бактериальной клетки наряду со световым микроскопом применяют электронно-микроскопические и микрохимические исследования, позволяющие определить ультраструктуру бактериальной клетки.

Бактериальная клетка (рис. 5) состоит из следующих частей: трехслойной оболочки, цитоплазмы с различными включениями и ядерного вещества (нуклеоида). Дополнительными структурными образованиями являются капсулы, споры, жгутики, пили.


Рис. 5. Схематическое изображение строения бактериальной клетки. 1 — оболочка; 2 — слизистый слой; 3 — клеточная стенка; 4 — цитоплазматическая мембрана; 5 — цитоплазма; 6 — рибосома; 7 — полисома; 8 — включения; 9 — нуклеоид; 10 — жгутик; 11 — пили

Оболочка клетки состоит из наружного слизистого слоя, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны.

Слизистый капсульный слой находится снаружи клетки и выполняет защитную функцию.

Клеточная стенка — один из основных структурных элементов клетки, сохраняющий ее форму и отделяющий клетку от окружающей среды. Важным свойством клеточной стенки является избирательная проницаемость, которая обеспечивает проникновение в клетку необходимых питательных веществ (аминокислот, углеводов и др.) и выведение из клетки продуктов обмена. Клеточная стенка сохраняет внутри клетки постоянное осмотическое давление. Прочность стенки обеспечивает муреин, вещество полисахаридной природы. Некоторые вещества разрушают клеточную стенку, например лизоцим.

Бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, называются протопластами. Они сохраняют способность к дыханию, делению, синтезу ферментов; к воздействию внешних факторов: механическому повреждению, осмотическому давлению, аэрации и др. Сохранить протопласты можно только в гипертонических растворах.

Бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой называются сферопластами. Если подавить процесс синтеза клеточной стенки с помощью пенициллина, то образуются L-формы, которые у всех видов бактерий представляют шаровидные крупные и мелкие клетки с вакуолями.

Цитоплазматическая мембрана плотно прилегает к клеточной стенке с внутренней стороны. Она очень тонкая (8-10 нм) и состоит из белков и фосфолипидов. Это пограничный полупроницаемый слой, через который осуществляется питание клетки. В мембране находятся ферменты пермеазы, осуществляющие активный перенос веществ, и ферменты дыхания. Цитоплазматическая мембрана образует мезосомы, принимающие участие в делении клетки. При помещении клетки в гипертонический раствор мембрана может отделиться от клеточной стенки.

Цитоплазма — внутреннее содержимое бактериальной клетки. Она представляет собой коллоидную систему, состоящую из воды, белков, углеводов, липидов, различных минеральных солей. Химический состав и консистенция цитоплазмы изменяются в зависимости от возраста клетки и условий окружающей среды. В цитоплазме находятся ядерное вещество, рибосомы и различные включения.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат. Ядерное вещество прокариотов в отличие от эукариотов не имеет собственной мембраны. Нуклеоид зрелой клетки представляет собой двойную нить ДНК, свернутую в кольцо. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки. По генетической терминологии ядерное вещество получило название генофор или геном.

Рибосомы находятся в цитоплазме клетки и выполняют функцию синтеза белка. В состав рибосомы входит 60% РНК и 40% белка. Количество рибосом в клетке достигает 10000. Соединяясь вместе, рибосомы образуют полисомы.

Включения — гранулы, содержащие различные запасные питательные вещества: крахмал, гликоген, жир, волютин. Они расположены в цитоплазме.

Клетки бактерий в процессе жизнедеятельности образуют защитные органеллы — капсулы и споры.

Капсула — внешний уплотненный слизистый слой, примыкающий к клеточной стенке. Это защитный орган, который появляется у некоторых бактерий при попадании их в организм человека и животных. Капсула предохраняет микроорганизм от защитных факторов организма (возбудители пневмонии и сибирской язвы). Некоторые микроорганизмы имеют постоянную капсулу (клебсиеллы).

Споры встречаются только у палочковидных бактерий. Они образуются при попадании микроорганизма в неблагоприятные условия внешней среды (действие высоких температур, высыхание, изменение рН, уменьшение количества питательных веществ в среде и т. д.). Споры находятся внутри бактериальной клетки и представляют уплотненный участок цитоплазмы с нуклеоидом, одетый собственной плотной оболочкой. По химическому составу они отличаются от вегетативных клеток малым количеством воды, увеличенным содержанием липидов и солей кальция, что способствует высокой устойчивости спор. Спорообразование происходит в течение 18-20 ч; при попадании микроорганизма в благоприятные условия спора в течение 4-5 ч прорастает в вегетативную форму. В бактериальной клетке образуется только одна спора, следовательно, споры не являются органами размножения, а служат для переживания неблагоприятных условий.

Спорообразующие аэробные бактерии называются бациллами, а анаэробные — клостридиями.

Споры отличаются по форме, размерам и расположению в клетке. Они могут располагаться центрально, субтерминально и терминально (рис. 6). У возбудителя сибирской язвы спора располагается центрально, ее размер не превышает поперечника клетки. Спора возбудителя ботулизма расположена ближе к концу клетки — субтерминально и превышает ширину клетки. У возбудителя столбняка округлая спора располагается на конце клетки — терминально и значительно превышает ширину клетки.

Жгутики — органы движения, характерны для палочковидных бактерий. Это тонкие нитевидные фибриллы, состоящие из белка — флагеллина. Длина их значительно превышает длину бактериальной клетки. Жгутики отходят от базального тельца, расположенного в цитоплазме, и выходят на поверхность клетки. Наличие их можно обнаружить по определению подвижности клеток под микроскопом, в полужидкой питательной среде или при окраске специальными методами. Ультраструктура жгутиков изучена в электронном микроскопе. По расположению жгутиков бактерии делят на группы (см. рис. 6): монотрихи — с одним жгутиком (возбудитель холеры); амфитрихи — с пучками или единичными жгутиками на обоих концах клетки (спириллы); лофотрихи — с пучком жгутиков на одном конце клетки (фекальный щелочеобразователь); перитрихи — жгутики расположены по всей поверхности клетки (кишечные бактерии). Скорость движения бактерий зависит от количества и расположения жгутиков (наиболее активны монотрихи), от возраста бактерий и влияния окружающих факторов.


Рис. 6. Варианты расположения спор и жгутиков у бактерий. I — споры: 1 — центральное; 2 — субтерминальное; 3 — терминальное; II — жгутики: 1 — монотрихи; 2 — амфитрихи; 3 — лофотрихи; 4 — перитрихи

Пили или фимбрии — ворсинки, расположенные на поверхности бактериальных клеток. Они короче и тоньше жгутиков и также имеют спиральную структуру. Состоят пили из белка — пилина. Одни пили (их несколько сотен) служат для прикрепления бактерий к клеткам животных и человека, с другими (единичными) связана передача генетического материала из клетки в клетку.

Микоплазмы

Микоплазмы — клетки, не имеющие клеточной стенки, но окруженные трехслойной липопротеидной цитоплазматической мембраной. Микоплазмы могут быть сферической, овальной формы, в виде нитей и звезд. Микоплазмы по классификации Берги выделены в отдельную группу. В настоящее время этим микроорганизмам уделяется все большее внимание как возбудителям заболеваний воспалительного характера. Размеры их различны: от нескольких микрометров до 125-150 нм. Мелкие микоплазмы проходят через бактериальные фильтры и называются фильтрующимися формами.

Спирохеты (см. рис. 52) (от лат. speira — изгиб, chaite — волосы) — тонкие, извитые, подвижные одноклеточные организмы, имеющие размеры от 5 до 500 мкм в длину и 0,3-0,75 мкм в ширину. С простейшими их роднит способ движения путем сокращения внутренней осевой нити, состоящей из пучка фибрилл. Характер движения спирохет различен: поступательное, вращательное, сгибательное, волнообразное. В остальном строение клетки типичное для бактерий. Некоторые спирохеты слабо окрашиваются анилиновыми красителями. Спирохеты разделяют на роды по количеству и форме завитков нити и ее окончанию. Кроме сапрофитных форм, распространенных в природе и организме человека, среди спирохет имеются болезнетворные — возбудители сифилиса и других заболеваний.

Риккетсии — микроорганизмы размером от 0,2 до 30 мкм. Они имеют обычное для бактерий строение клетки: двуслойную оболочку, цитоплазму, нуклеоид. По форме риккетсии могут быть палочковидными, нитевидными и кокковидными. Все риккетсии внутриклеточные паразиты, т. е. могут развиваться только в клетках живого организма. Они вызывают такие инфекционные заболевания, как сыпной тиф и различные лихорадки. Переносчиками риккетсии являются членистоногие: клещи, вши и блохи, в организме которых риккетсии размножаются.

Вирусы (см. рис. 53) — мельчайшие организмы неклеточного строения. Вирусная частица носит название вирион. Размеры вирионов составляют от 15 до 400 нм. Большинство вирусов можно увидеть только с помощью электронного микроскопа. Оболочка вириона, капсид, состоит из молекул белка. Внутри находится нуклеиновая кислота только одного типа — ДНК или РНК. По типу нуклеиновой кислоты вирусы делятся на две группы — ДНК и РНК вирусы. Все вирусы являются облигатными (обязательными) паразитами и в лабораториях культивируются в куриных эмбрионах, организме животных или культуре тканей. Форма вирионов разнообразна: сферическая, палочковидная, кубоидальная и сперматозоидная. Размножение вирусов осуществляется путем раздельного синтеза оболочки и нуклеиновой кислоты в клетке хозяина с последующей сборкой вирионов. Этот процесс называется репродукцией. В организме хозяина некоторые вирусы образуют внутриклеточные включения и элементарные тельца, которые видны в обычном световом микроскопе, так как величины их составляют несколько микрометров. Эти образования имеют диагностическое значение. Вирусы вызывают заболевания бактерий, растений, животных. Важнейшими инфекционными заболеваниями человека вирусной природы являются грипп, корь, полиомиелит, гепатит и бешенство.

Среди вирусов выделяют группу фагов (от лат. phagos — пожирающий), вызывающих лизис (разрушение) клеток микроорганизмов. Сохраняя присущие вирусам свойства и состав, фаги отличаются структурой вириона (см. главу 8). Они не вызывают заболеваний человека и животных.

Контрольные вопросы

1. Расскажите о классификации микроорганизмов.

2. Назовите основные свойства представителей царства прокариотов.

3. Перечислите и охарактеризуйте основные формы бактерий.

4. Назовите основные органеллы клетки и их назначение.

5. Дайте краткую характеристику основных групп бактерий и вирусов.

Изучение морфологии микроорганизмов

Для изучения морфологии микроорганизмов применяют микроскопический метод исследования. Важным условием успешного использования этого метода является правильное приготовление мазка из исследуемого материала или бактериальной культуры. Культурой называются микроорганизмы, выращенные на питательных средах в лабораторных условиях.

Техника приготовления мазка

Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.

Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.

Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.

Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.

Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.

Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.


Рис. 7. Игла и петли для посева. 1 — игла; бактериальные петли: 2, 3 — петли приготовлены неправильно; 4 — петля приготовлена правильно

Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.

Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.

Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.

Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.

Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.

Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции. Поверхность органа или пищевого продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу в двух — трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.

Высушивание мазка

Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.

Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.

Фиксация мазка

Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.

Способы фиксации. 1. Физический — в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.

2. Химический — в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом — 10 мин; в) смесью Никифорова — 10-15 мин; г) ацетоном — 5 мин; д) парами кислоты и формалина — несколько секунд.

Окраска препаратов

После фиксации приступают к окраске препарата.

Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.

Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.

Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.

Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.

Рецепты красителей

1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):

Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.

2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):

Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.

Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.

3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):

Краситель готовят непосредственно перед применением.

4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):

насыщенного спиртового раствора

генцианового фиолетового — 10 мл

карболовой кислоты 5% — 100 мл

Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):

Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.

6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:

7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.

Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.

Простой метод окраски

Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера — 1-2 мин (см. рис. 4).

На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы — грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.

1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.

2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.

3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Окраска по Цилю — Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий). Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные — в синий (см. рис. 4).

Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля — Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка — в голубой цвет (см. рис. 4).

Окраска по Бурри — Гинсу (выявление капсулы). Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.

2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки — красные, капсулы — неокрашенные (см. рис. 4).

Прижизненная окраска микроорганизмов

Для изучения живой культуры используют чаще всего метиленовый синий и другие красители в больших разведениях (1:10000). Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с каплей красителя и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с помощью объектива 40×.

Изучение подвижности микроорганизмов

Для исследования используют культуру бактерий, выращенных в жидкой питательной среде, или взвесь бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида.

Метод раздавленной капли. На предметное стекло наносят пипеткой каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. Чтобы не образовывалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения препарата от высыхания его помещают во влажную камеру.

Влажная камера представляет собой чашку Петри, на дне которой находится влажная фильтровальная бумага. На бумагу кладут две спички и на них помещают препарат. Чашку закрывают крышкой.

Микроскопируют при увеличении объектива 40х в темном поле (см. главу 2).

Метод висячей капли (рис. 8). Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло и вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина.


Рис. 8. Камера с висячей каплей

На покровное стекло наносят каплю культуры. Затем осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. При микроскопии сначала при малом увеличении (8×) находят край капли, а затем проводят изучение препарата при большом увеличении.

Контрольные вопросы

1. Как приготовить бактериальную петлю?

2. Назовите цели и способы фиксации мазков.

3. Назовите основные красители.

4. Какими методами изучают подвижность микроорганизмов?

1. Возьмите готовые препараты, изучите их и зарисуйте основные формы микроорганизмов.

2. Приготовьте мазки из различного материала (культуры, гноя, крови, мазки-отпечатки).

3. Окрасьте препараты сложными методами (по Граму, Цилю — Нильсену, Ожешко, Бурри — Гинсу).

biologylib.ru

Микра / Занятия / 2. Методы исследования морфологии бактерий

ТЕМА: МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение.

Капсулы бактерий, их значение.

Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.

Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.

Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии. КОН-тест. Принцип метода.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Техника окраски по Граму (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания по методу Грама/ раскрасить таблицу)

1. Окрашивание генцианвиолетом (генциановым фиолетовым)

2. Обработка раствором Люголя

(время экспозиции 1минута ))

(время экспозиции 1минута )

4. Окрашивание водным фуксином или сафранином

(время экспозиции 2 минуты ))

Основные морфологические группы бактерий (изобразите в виде цветных рисунков в соответствии с окраской по Граму):

1►Окраска по Граму мазков из бульонной культуры стафилококка, агаровой культуры кишечной палочки и их смеси. Зарисовка препаратов.

(Staphylococcus aureus, Escherichia coli)

2►Приготовление мазка из культуры дифтерийной палочки, окраска метиленовым синим по Леффлеру и по Нейссеру. Зарисовка препаратов.

Окраска по Леффлеру

Окраска по Нейссеру

3►Постановка и учет результатов КОН-теста с культурами золотистого стафилококка и кишечной палочки.

Результат КОН-теста (с 3% раствором) Staphylococcus aureus стенка не разрушается, Escherichia coli стенка разрушается образуются тянущиеся за петлей слизистые нити .

окраска метиленовым синим по Леффлеру

Палочки неправильной формы, беспорядочно,

Коккобактерии – слегка вытянутые палочки

Палочки с закругленными концами

Стрептобациллы, образующие в организме капсулу

(указать методы окраски микроскопических препаратов и особенности морфологии микроорганизмов – форму и расположение в препарате)

4►Приготовление мазка из агаровой культуры спороносных бацилл, окраска по Цилю-Нельсену (или по методу Ожешко), микроскопия и зарисовка.

Техника окраски по Цилю-Нельсену (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания/ раскрасить таблицу)

Окраска спор по Ожешко

На нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р HСl и подогревают 1-2 минуты над рламенем, промывают водой, фиксируют и далее см. ниже

Окраска кислото-устойчивых бактерий

1. Обработка на мазок наносят фильтровальную бумагу наливают карболовый фуксин Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров

(время экспозиции до отхождения паров )

Также необходимо снять бумажку, остудить препарат, сполоснуть водой

3. Окрашивание водным раствором метиленового синего

(время экспозиции) 3-5 минут

* МТ – Mycobacterium tuberculosis; Str – стрептококк.

5►Микроскопия препаратов микроорганизмов, окрашенных по Цилю-Нельсену. Зарисовка препаратов.

Окраска по Цилю-Нельсену.

Mycobacterium tuberculosis в мокроте

6►Приготовление мазка из агаровой культуры палочки риносклеромы, окраска по Бурри-Гинсу, микроскопия и зарисовка.

Окраска по по Бурри-Гинсу

7►Приготовление препарата «раздавленная капля» или «висячая капля» из сенного настоя для изучения подвижности (указать особенности микроскопии препарата)

Нанесение взвеси микроорганизмов на покровное стекло;

Смазывание краев лунки на предметном стекле вазелином и помещение покровного стекла на предметное стекло; 3)Готовый препарат, микроскопируют с иммерсионным обьективом

Бакте́рии (др.-греч. βακτήριον — палочка) —группа (царство)прокариотных(безъядерных)микроорганизмов, чаще всегоодноклеточных. К настоящему времени описано около десяти тысячвидовбактерий и предполагается, что их существует свыше миллиона, однако само применение понятия вида к бактериям сопряжено с рядом трудностей.

Спириллы отличаются спиральным (штопор) строением клетки и биполярным расположением жгутиков; энергию они получают за счет дыхания. Выделяют несколько родов спирилл. S. volutans — гигантская спирилла, которую всегда можно найти в свиной навозной жиже; она получила известность благодаря открытию «волютина» (полифосфатов); в чистой культуре растет только при пониженной концентрации 02 (примерно 5%), ее следует поэтому считать микроаэротолерантнои.Spirillum minus –возбудитель Содоку – болезни укуса крыс.

Метод Нейссера используется для выявления зерен волютина. Мазок окрашивается уксуснокислым метиленовым синим 2-3 минуты, при этом происходит химическое взаимодействие красителя и волютина. Зерна волютина окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем в течение 1 мин докрашивается везувином в желто-коричневый цвет.

Метод Циля-Нильсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.

Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин.

Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.

Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена,но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. После протравы соляной кислотой при нагревании в течение 2-3 мин мазок фиксируется и окрашивается по методу Циля-Нильсена. При этом цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный.

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсульныхбактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу — водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.

studfiles.net

Смотрите так же:

  • Размер судебной госпошлины Арбитражный суд Республики Бурятия Размеры уплаты госпошлины Статья 333.21 Налогового Кодекса Российской Федерации от 05.08.2000 N 117-ФЗ Размеры государственной пошлины по делам, рассматриваемым в арбитражных судах. 1. По делам, […]
  • Работа парикмахером в москве с проживанием Вакансии - работа парикмахером Работа парикмахером - нелегкий труд, но при определенной квалификации зарплата парикмахера может перевалить за 50000 руб. Правда, такой уровень зарплат имеет место быть только в крупных мегаполисах, таких, […]
  • Кем принимаются федеральные законы если иное не предусмотрено Статья 106 Конституции РФ Обязательному рассмотрению в Совете Федерации подлежат принятые Государственной Думой федеральные законы по вопросам: а) федерального бюджета; б) федеральных налогов и сборов; в) финансового, валютного, […]
  • Правила умножения и деления рациональных чисел Правила умножения и деления рациональных чисел Чтобы перемножить два рациональных числа, надо перемножить их модули и перед результатом поставить знак плюс, если оба множителя имеют одинаковые знаки, или минус, если множители имеют […]
  • Контрольная работа газовые законы Контрольная работа по теме: «Основы МКТ, газовые законы»Контрольная работа по физике «Основы МКТ, газовые законы» Кравченко Лора ВикторовнаУчитель физикиМБОУ «Гуманитарно-юридический лицей №86»город Ижевск, Удмуртская […]
  • Ас спб госпошлина Справка о размерах государственной пошлины Справка о размерах государственной пошлины Государственная пошлина Статья 333_21. Размеры государственной пошлины по делам, рассматриваемым Верховным Судом Российской Федерации, арбитражными […]